一、Southern雜交
問題1：電泳后發現凝膠中DNA擴散，導致結果難以確定，如何解決這一問題？
解決方案：（1）在操作上：電泳時隔孔上樣，電泳后要對凝膠及時處理使凝膠干燥；（2）瓊脂糖的質量應該較好，尤其是不應含有內切酶，否則有時將使低拷貝數基因的雜交結果難以解釋。
問題2：傳統方法中轉膜不完全的問題如何克服？
解決方案：經典的向上轉移法會使凝膠短時間內變薄,此時即使延長轉移時間至24小時以上,也不能使大分子DNA良好地轉移出去,因此,轉膜不完全。向下轉膜法由于不需在吸水紙上增加重量,凝膠基本不變形；加之吸水紙的吸力與水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的轉移,它不需要特殊的儀器,轉移速度較快,轉移效率高。
利用地高辛標記探針進行 Southern 雜交時，對于大于15kb的 DNA片斷，轉膜之前用鹽酸進行脫嘌呤可以促進轉膜效率, 但脫嘌呤過度可導致分子量相對較小的 DNA 被打斷成過小的片段而難以和尼龍膜結合。如果實驗轉膜過程中同時含有大于 15kb的DNA(通常為基因組)和小片段DNA(通常是基因組酶切產物)，那么在轉移的過程中傾斜容器，僅使凝膠上半部分浸泡于鹽酸，這樣既可以提高大片斷 DNA 的轉移效率，又不會打碎小片段DNA。
另外，等采用瓊指糖凝膠直接雜交的方法，來解決這一難題：以轉基因鼠的檢測為例，實驗步驟如下：1.轉基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’調控區指導人G-CSF基因為構件，建立轉基因小鼠。轉基因小鼠的檢測采用剪取鼠尾DNA做Southern進行鑒定。2.瓊脂糖凝膠直接雜交 （1）用BanHI(150U)對由假孕鼠產生的仔鼠剪尾提取基因組DNA10μg酶切過液，取少量電泳檢查酶切完全后，上樣電泳8小時，(2)將電泳槽板連同凝膠置50℃放置3小時，用鑷子輕輕揭起凝膠，放于變性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分鐘，轉置中和液(0.5MTrisHCl 0.15MNaCl)20分鐘，將膠放于玻璃板上瀝干液體，室溫放置30分鐘。(3)干膠應立即雜交。先將膠在水中泡一下，以利于操作。(4)將膠放人雜交液(6×SSC、5×Denhardt’S、0.25% SDS、100μg/ml鮭魚精DNA)，加人探針，42℃雜交16-20小時。(5)雜交完成后，洗膜8輪，42℃每次15分鐘。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗兩次，在冰水中浸泡2分鐘，以利于鹽的排出。(6)干燥后按檢測試劑盒操作，室溫壓片0.5-2小時。沖片照相。使用的探針為G-CSF。DNA，探針標記采用Fluorescein-12-dUTP，檢測試劑盒為杜邦公司產品，操作按試劑盒說明書進行。用瓊脂糖凝膠直接雜交的方法，較好地解決了微量核酸或低拷貝數轉基因的檢測問題，結果不僅直觀，而且特異性好。與常規的Southern雜交相比，它所具有的優勢是，它省略了將DNA進行轉膜的步驟，從而避免了因轉膜不完全所造成的DNA量的損失，特別是低拷貝數基因的丟失。另一方面，也使復雜的Southern雜交操作程序大大簡化。因此，在轉基因鼠的鑒定中以及微量核酸檢測、疾病診斷中是防止低拷貝數基因漏檢的一種可行途徑。
問題3：在向下轉膜法中，如何提高轉膜效率？
解決方案：1、轉移液的水平面應略低于凝膠的水平面。如果轉移液的水平面高于凝膠，短時間內會有大量液體聚集在凝膠上，直接從側面流失；果轉移液的水平面過分低于凝膠，影響紗布的吸水力，轉移效率下降。2、吸水紙吸水后易變形，使吸水紙與濾紙間產生空隙，而降低吸水紙的吸水效率，應及時更換吸水紙。3、過夜轉移時，及時添加轉移液，防吸干。4、樣本豐度高時，移時間可以縮短至1小時，此時凝膠上仍可見大分子量DNA的殘留，當樣本豐度低時，以延長轉移時間。5、紗布上不要加蓋重物，防凝膠受壓變薄，響轉移效率。
問題4：堿轉移結束后的尼龍膜潮濕不利于保存，且防止長期保存過程中DNA結合不緊密影響雜交效果，應如何做？
解決方案：將尼龍膜置于濾紙上干燥片刻，在紫外交聯儀中將轉有DNA的一面向上12000J交聯4 min，若尼龍膜暫不雜交，可在4℃下保存備用但存放時間不宜超過半年。
問題5：使用堿轉移法，將導致雜交后探針的去除困難，幾乎80%-90%的探針難以洗脫，如何解決這一問題？
解決方案：將煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷卻至室溫,可除去膜上已雜交的DNA探針。洗脫后的尼龍膜,可反復用于其他探針的雜交(至少可耐5輪雜交與洗脫)。
問題6：Southern雜交中，探針的背景高，應如何解決？
解決方案：用隨機引物法標記的探針要想得到最低的背景，在向尼龍膜上加prob-DIG Easy H yb混合物前,要用0.45μm醋酸纖維素膜過濾，勿用硝酸纖維素濾膜過濾。對每一個探針和目的片段，總是要根據經驗確定最合適的雜交條件，探針濃度很關鍵，如果太高，將會非特異性結合到膜上；太低，敏感性會降低。
利用地高辛標記探針進行 Southern 雜交時，以下 2 種措施可降低背景：(1)適當延長梯度洗膜的時間和提高洗膜溫度；(2)控制地高辛抗體的濃度。使用足夠量的地高辛抗體可以獲得較好的雜交信號, 但過量的地高辛抗體會在膜上產生非特異結合斑點。
問題7：Southern雜交沒有檢測出出雜交信號的原因，如何解決？
解決方案：（1）目的DNA在總DNA中所占的比例，一般需要 10μg DNA 樣品, 如果樣品中目的基因含量較高, 可以按比例減少DNA用量。如果基因組中目的基因的拷貝數較低, 致使常規的基因組用量不能滿足Southern 雜交的需要, 此時可加大基因組的用量；（2）探針的濃度和比活性：在雜交袋中雜交需要0.2ml/cm2的雜交液；使用圓筒狀瓶子進行雜交可以使用較小的體積，約 0.1ml/cm2。（3）轉移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對：（見問題2，3）
二、Western blot中常見問題
問題1： 在western實驗中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么區別？
選擇合適的緩沖液對于維持一定PH值下蛋白質的穩定及保證實驗的重復性是很重要的。PBS的緩沖能力強于TBS（因為混合緩沖液在一定的離子強度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過PBS易污染）。但我們常常要根據我們實驗目的選用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進行陰離子交換層析，陽離子緩沖液首選TBS；陽離子交換層析時，陰離子緩沖液則首選PBS。Western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據需要選擇合適的濃度。
問題2：沒有注明可以用來做Western blot的一抗，可以用來做Western blot嗎？
不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構象型表位的，識別構象型表位的抗體不能用于Western blotting，因為在Western blotting中抗體識別的是完全變性的蛋白質抗原，而蛋白質抗原的構象型表位變性時被破壞
問題3：做Western每次只加一種一抗，可以同時加兩種或者多種一抗的嗎？
最好還是不要同時加兩種一抗。因為如果結果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。
問題4：Western blot 使用的膜哪種最好啊，PVDF好還是NC膜，如何選擇？
PVDF膜價格較貴，可重復使用，特別適合蛋白印跡，結合能力較強，但價格比較昂貴。 NC膜價格比較便宜，應用較廣，結合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關文獻
問題5：為什么出現了多條帶,每個加樣槽中都出現了多條帶，而且好象都很有規律,為什么?是封閉時間不夠嗎？做Western必須要內參嗎？
一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應，抗體的特異性不強，目的蛋白經過處理后發生變化,而內參的條帶基本均勻一致.這樣才有說服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴格意義上說,內參是必須做的。
問題6： Western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些？用于Western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？
作為Western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，可以去看看EarthOx他們家的，種類比較全，價格也比較合理。用于Western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于Western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構像特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。
做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶
問題7：半干轉是否要求膜，濾紙，膠同樣大��？因為膠大小不一定規則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發現短路呢？
可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。
問題8：Western blot哪種染色好？
（1） 陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去 ，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
（2） 膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩定。
（3） 生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。
問題9：不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？
可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優化的轉移緩沖液，可以參考《蛋白質技術手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓／電流；增加轉移時間
問題10： DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？
DAB顯色在辣根過氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產物，該產物難溶于醇和其他有機溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導致與四氧化鋨反應而增加其染色強度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結合而產生有色的、不溶性偶氮染料
問題11：酶顯色與熒光顯色之間，各自的優缺點是什么？
免疫酶技術就是用酶(如辣根過氧化物酶)標記已知抗體(或抗原)，然后與組織標本在一定條件下反應，如果組織中含有相應抗原(或抗體)，抗原抗體相互結合形成的復合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產生顯色反應，這樣就可以識別出標本抗原(抗體)分布的位置和性質，通過圖像分析并可達到定量的目的
免疫熒光技術雖已廣泛應用于免疫學的研究與診斷，但是熒光抗體染色標本不能長期保存，對組織細胞的細微結構分辨不清，免疫酶技術則能克服上述不足，標記免疫酶技術的敏感性更優于免疫熒光法，對石蠟切片標本尤為適用，為免疫病理研究開辟了一條新途徑，酶顯色產物具有較高的電子密度，經過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術，前者是將酶通過交聯劑結合在抗體分子上，形成酶標記抗體。后者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的免疫反應，稱為非標記抗體酶技術
問題12：請問資料上所說的PVDF膜可以重復利用是什么意思？可以重復利用幾次？
重復利用指的是可以在顯影定影完成以后重新洗脫（stripping buffer）然后重新封閉，一抗（可以是不同的，前提是目的蛋白在pvdf膜上），二抗孵育，顯影定影。重復利用的情況還要看你的蛋白豐度 ，每一次stripping都會洗掉蛋白，同時有些抗體結合緊的也洗不完全，所以要看你的實驗情況而定
問題13：結合ECL之后顯影發現膠片上的條帶是空心的，而且熒光很快就沒了？
一種情況是POD濃度高ECL很快被淬滅掉，導致蛋白豐度越高的地方反而沒帶，邊緣地帶反而有顯色
問題14：要做磷酸化某因子Western blot，其二抗有何要求？
對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗，EarthOx的質量過硬，價格公道且種類比較全，建議去他們網站查一下。
問題15：Western blot結果中雜帶較多
可能的原因及建議：
1）目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙�；稽c等），本身可以呈現多條帶。
查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。
2）一抗特異性不高
重新選擇或制備高特異性的抗體，建議去國外品牌網站查一下，比如EarthOx的一抗。
3）一抗不純
建議同上，或者自己純化抗體
三、外源基因在大腸桿菌的表達
問題1：外源基因在大腸桿菌中高效表達易形成包含體，包含體形成有利于表達產物的純化，但降低產生大量不具有生物活性的產物，如何降低包涵體的形成？
解決方案：（1）采用胰胨-磷酸鹽培養基能夠限制包含體的形成。（2）培養液中加入甜菜堿和山梨醇來改變滲透壓，使表達產物由包含體形式轉變為活性狀態，將溫度從37℃降低到25℃時誘導表達，可降低包含體的形成。（3）選用pMBI衍生而來的載體質粒，因為其可以協同表達DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加凝結蛋白的溶解度。分子伴侶折疊作用效率與細胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的濃度有關，與表達蛋白的性質有關。
問題2：在lac、tac 表達系統中IPTG 用于誘導lac、tac啟動子的轉錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對表達和制備用于醫療目的的重組蛋白并不適合。一些國家規定在生產人用重組蛋白質的生產工藝中不能使用IPTG，應如何做？
解決方案：（1）lac 和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控：把阻遏蛋白 LacI 的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達載體或整合到染色體后，均能使 lac 和tac啟動子的轉錄受到溫度嚴緊調控在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42℃）時開放。（2）用乳糖替代IPTG誘導lac和tac啟動子的轉錄：乳糖在Β-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導劑的作用這一過程涉及乳糖的轉運和轉化，其效率受到多種因素的影響和制約因此乳糖誘導的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代 lPTG 作為誘導劑的研究要與發酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。
問題3：T7表達系統表達目的基因的水平是目前所有表達系統中最高的，但也不可避免出現在相對較高的本底轉錄，如果目的基因產物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。
解決方案：在表達系統中低水平表達T7溶菌酶基因：因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與T7 RNA聚合酶結合抑制其轉錄的活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉化質拉導入表達系統，它能明顯降低本底轉錄，但對誘導后目的基因的表達水平無明顯影響。
問題4：為了提高外源基因的表達水平，對表達載體如何進行改進？
解決方案：(l)可誘導拷貝數的表達載體。質粒的拷貝數由培養條件控制，當需要增菌培養時，質粒的拷貝數很低，每個細胞僅1-5個拷貝，經適當條件誘導后，載體拷貝數可達每個細胞100-500個拷貝。這種表達載體的優點減小了載體質粒的丟失，保證質粒在大腸桿菌中的穩定性，對外源基因的表達調控更為嚴格，有利于基因的高效表達。這里主要有兩類條件控制拷貝數的表達載體，一類是基于質粒Rl基礎上的單復制起始表達載體；另一類是雙復制起始表達載體，一個復制起始來源于Co1EI，另一個來源于質粒pSC101。(2)多順反子型表達載體。這種表達載體的設計在于將第二個順反子的SD序列插入在第一個順反子的終止密碼子TAA之前，第一個順反子要盡量短，后面接目的基因的起始密碼子ATG。由于第一個順反子翻譯地有效起始，使得大量的核糖體結合在多順反子mRNA上，促進了核糖體對第二個順反子的SD序列的識別和翻譯起始，從而提高了表達水平。(3)帶翻譯增強子的表達載體。atpE基因SD序列上游的一段序列對其表達具有促進作用，它位于SD序列上游2-7bp處，這段序列在atpE基因的mRNA上核昔酸順序為UUUUAACUGAAACAAA，將其插入到其它表達載體內構建的新型表達載體，對Β-干擾素和IL-2的表達提高了6-8倍。T7噬菌體基因10的mRNA中有一個翻譯增強子，它是一段與16sRNA的互補序列，提高了核糖體與翻譯起始區的親和力，將其插入SD序列上游或起始密碼子下游均可提高翻譯起始效率。
問題5：質粒的過度增殖以及其后目的基因的高效表達影響受體細胞的生長代謝，導致重組質粒的不穩定性以及目的基因宏觀表達水平的下降。如何解決？
解決方案：將重組質粒的擴增納入可控制的軌道：（1）采用條件控制拷貝數的表達載體，一類是基于質粒Rl基礎上的單復制起始表達載體；另一類是雙復制起始表達載體，一個復制起始來源于Co1EI，另一個來源于質粒pSC101；（2）將外源基因插入到大腸桿菌的染色體中chopin等報道，將分泌型IGF-I的基因，采用串連式的重復方式插入到大腸桿菌染色體的attλ位點，在不添加抗生素誘導的條件下，采用高密度發酵，IGF-I基因十分穩定。
問題6：在分泌型異源蛋白的表達中，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質的免疫性質和藥理性質，應如何去除？
解決方案：⑴ 在表達系統中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因。 ⑵ 在分離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。
問題7：把所表達的目標蛋白外泌到細胞外的培養基中可以進一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。如何實現目標蛋白的外分泌表達？
解決方案：（1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達；（2）與一些能提高細胞外膜通透性的因子融合或共表達；（3）改變培養基的成分。但方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。
問題8：如何使外源基因高效表達？
解決方案：（1）表達質粒的優化和設計：構建表達質粒時首先要考慮使目標基因的翻譯起始密碼ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個適當的范圍內。核糖體結合位點序列的變化對 mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現為：SD序列 UAAGGAGG的翻譯效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是6-8個堿基長度，與 AAGAA 的最適距離是5-7個堿基長度；ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3-4個堿基，與 AAGAA 至少相隔5 個堿基mRNA 的翻譯才能進行；ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T 堿基豐富時，mRNA 翻譯效率較高。其次，盡量提高核糖體結合位點本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“莖環”結構的可能性，也是構建表達質粒時需要注意的事項。在必要的情況下，還可通過定點突變，PCR 等技術改變個別關鍵的堿基來破壞mRNA 5’端的“莖環”結構。把目標基因設計成多順反子結構，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標基因，一起插入表達載體。這一方法通常適用于目標基因 5’端序列容易形成二級結構，而又不宜改變其序列的情形下。再者，在構建表達質粒時，充分利用各個基因的結構特征和特點，注意引入翻譯增強子序列。（2）共表達大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因：由于同義密碼子的使用頻率與細胞內對應的tRNA的豐度有正比關系稀有密碼子對應的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發生中止和移碼突變�？刹捎�1.通過基因突變把稀有密碼子改變為其他使用頻率高的同義密碼子；2.在表達系統中共表達稀有密碼子tRNA 基因，以提高大腸桿菌細胞內稀有密碼子 tRNA 的豐度。（3）提高目標基因mRNA和目標基因產物的穩定性：利用蛋白轉運系統把目標蛋白最終累積在周質空間，或分泌到培養基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯聚合表達；共表達能提高特定目標蛋白穩定性的輔助因子，如分子伴侶基因；對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區域和識別位點進行改造；在較低的溫度下培養菌體和優化發酵條件。（4）高密度發酵和工程化宿主細胞：：大腸桿菌高密度發酵是大規模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標基因的表達水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數量的成倍增加來實現總表達量的提高。目前常用的發酵方式有：恒定培養、流加補料培養、連續培養三種。工程化宿主細胞：1.構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌是解決高密度發酵后期由于菌體的生長密度較高，培養基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標基因的高效表達有明顯的阻抑作用的根本途徑。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學性質，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb 導入大腸桿菌細胞內以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值；用基因敲除技術缺失大腸桿菌的磷酸轉乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷；改變代謝流的方向，通過共轉化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進行。2.構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因編碼大腸桿RNA聚合酶的r32亞基，r32 亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調控作用。rpoH 基因缺陷的突變株己經被構建，研究結果表明它能明顯提高目標基因的表達水平。
四、PCR反應
問題1：假陰性，不出現擴增條帶
可能原因：
（1）模板：①模板中含有雜蛋白質；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚，模板本身拷貝數低；⑤模板核酸變性不徹底。
對策：純化模板；配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改；如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA。
（2）酶失活
對策：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
（3）引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，
對策：①選定一個好的引物合成單位；②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度；③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效；④引物設計不合理，如引物長度不夠引物之間形成二聚體等，需重新設計引物。
（4）Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
對策：調整Mg2+濃度，從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反應，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。注意：對實時定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。
（5）反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要摸索條件，否則容易失敗。
（6）物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。
對策：優化PCR溫度，有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度。
（7）靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
問題2：假陽性：出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
可能原因：
（1）引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。
對策：需重新設計引物。
（2）靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：
一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。
對策：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生。
對策：可用巢式PCR方法來減輕或消除。
問題3：出現非特異性擴增帶
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：
（1）引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。（2）Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。（3）酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。
對策：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。⑤降低Mg2+濃度。
問題4：出現片狀拖帶或涂抹帶
可能原因：酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多。
對策：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環次數。
五、 RT-PCR反應
問題1：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物
可能原因：
（1）RNA被降解
對策：①在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA，使用良好的無污染技術分離RNA；②在將組織從動物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲存RNA；③如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。
（2）RNA中包含逆轉錄抑制劑
對策：通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對RNA沉淀進行清洗�？梢约尤胩窃�0.25μg到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復。（逆轉錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。）將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反應比較產量以檢驗抑制劑。
（3）多糖同RNA共沉淀
對策：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。
（4）用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火
對策：①確定退火溫度以適合引物。對于隨機六聚體，建議在反應溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘。②對于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機六聚體。③確定GSP是反義序列。
（5）起始RNA量不夠
對策：增加RNA量。對于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
（6）RNA模板二級結構太多
對策：①將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火。②提高逆轉錄反應溫度，對SuperScriptⅡ可以到50℃，對ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃時使用oligo(dT)引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP。對于＞1kb的RT-PCR產物，保持反應溫度≤65℃。不要在高于37℃時使用M-MLV。③如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應中使用隨機引物。
（7）引物或模板對殘余的RNA模板敏感 對策：在PCR前用RNaseH處理。
（8）靶序列在分析的組織中不表達 對策：嘗試其他靶序列或組織
（9）PCR沒有起作用
對策：對兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉錄反應產物。
問題2：污染造成假陽性
可能原因：
（1）樣品間的交叉污染
對策：①收集樣品的容器最好使用一次性的，如重復使用，應在使用前應于180℃的高溫下干烤6小時或更長時間；②樣品存放時要密封嚴實，以防外溢造成相互間的交叉污染；③樣品在提取過程中離心管及吸樣槍頭最好使用一次性的，以免不同實驗樣品間相互污染；④由于吸樣槍污染會導致樣品間的污染，也是一個值得注意的問題，由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取時要十分小心，吸時要慢，吸取盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染；⑤同時要注意操作時不要劇烈地搖動反應管，開蓋時也容易造成氣溶膠污染。每次實驗完畢都要及時清理實驗臺面，用0.5%次氯酸鈉消毒后再打開紫外燈照射半小時。
（2）RT-PCR本身使用的試劑污染在試劑配制過程中，由于加樣槍、容器及其它溶液被污染。
對策：所有試劑都應盡量小量分裝，以減少重復加樣次數，避免污染機會，另外RT-PCR試劑應盡可能密封好分類存放。每次操作完畢后同樣要進行臺面消毒和紫外線照射消毒。
（3）擴增產物的污染，極微量的擴增產物污染就可造成假陽性。
對策；每次實驗完后，擴增產物都要及時密封后處理。設陽性對照。
（4）操作人員污染：只要存在少量的RNA酶就會引起RNA的降解，從而影響結果的準確性，RNA酶可存在操作人員手汗、唾液中，也可灰塵中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成實驗失敗。
對策；操作人員應戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。設置PCR操作專用實驗室，所用實驗用具應為專用，并合理分隔實驗室，將樣品的提取、配制RT-PCR反應液、PCR循環擴增等步驟分室進行，實驗前應將實驗室及實驗人員工作服用紫外線或臭氧消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
問題3：在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果
可能原因；
（1）對照RNA中含有痕量DNA。
對策：第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。
（2）有可能是引物二聚體的條帶。
問題4：擴增產物滯留在加樣孔中
可能原因：由于模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物。
對策：將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。
問題5：GAPDH內參抗體的選擇
在Western Bloting實驗中，可能存在總蛋白濃度測定不準確，或者蛋白質樣品在電泳前上樣時產生的樣品間的操作誤差；這些誤差可以通過測定每個樣品中實際轉到膜上的內參，比如內參GAPDH的含量來進行校正。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是GAPDH抗體—GAPDH內參抗體大全參與糖酵解的一種關鍵酶，由4個30-40kDa的亞基組成，分子量146kDa，檢測條帶大約在36kDa。 GAPDH基因幾乎在所有組織中都高水平表達，廣泛用作Western blot蛋白質標準化的內參。
內參抗體雖然選擇較多，但是也需要遵循一定的原則，并契合實際的應用要求。首先，我們需要考慮目的蛋白的大小，我們推薦內參要與檢測的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根據你目的檢測蛋白的分子量來選擇合適的內參，由于GAPDH的檢測分子量大約在36kD，因此該內參抗體不是很適合用于檢測30kD-40kD大小目標蛋白的WB實驗中。另外，不同的組織來源的樣本在選擇內參時還有一定的區別。比如某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內參。
我用過美國EarthOx公司的E021010 anti-GAPDH Mouse Monoclonal antibody，該抗體為單克隆抗體，其抗原為同時具有蛋白特異性和種屬通用性的GAPDH蛋白部分序列，其檢測種屬非常的廣泛，可識別人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、雞、豬和綿羊的GAPDH蛋白，是一個真正保守的內參抗體。并且效價很高，能達到1:1000—10000的稀釋倍數，性價比超高。
問題6：如何選擇β-actin內參抗體
Actin即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作為內參是得到了公認的，這是針對大多數組織和細胞來說的，它廣泛分布于細胞漿內，表達量非常豐富，其含量占所有細胞總蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情況下，如脂肪組織或細胞β-Actin抗體推薦—高效價的內參抗體內，β-Actin的表達量就很少。β-actin由375個氨基酸組成，分子量大小為42-43kDa左右。
內參抗體雖然選擇較多，但是也需要遵循一定的原則，并契合實際的應用要求。首先，我們需要考慮目的蛋白的大小，我們推薦內參要與檢測的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上，因此你需要根據你目的檢測蛋白的分子量來選擇合適的內參，由于β-Actin的檢測分子量大約在42kD，因此該內參抗體不是很適合 用于檢測38kD-48kD大小目標蛋白的WB實驗中。另外，雖然β-Actin是最合適的內參抗體之一，但是在某些條件下，一些因素也會導致樣品間β-Actin含量的變化。特別需要注意的是，在脂肪組織里，β-Actin的表達量非常低，不適合作為內參。
問題7：如何選擇tubulin內參抗體
Tubulin即微管蛋白，是細胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kDa和50kDa，其實際檢測條帶均在55kDa左右。作為內參，β-tubulin的蛋白水平通常不會發生改變，因此被廣泛用于Western Blotting時上樣量是否一致的參照，α-Tubulin和β-Tubulin構成微管蛋白的結構也常被用于免疫染色觀察細胞的微管結構。
問題8：如何選擇合適的β-Tubulin抗體？
內參抗體雖然選擇較多，但是也需要遵循一定的原則，并契合實際的應用要求。首先，我們需要考慮目的蛋白的大小，我們推薦內參要與檢測的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根據你目的檢測蛋白的分子量來選擇合適的內參，由于β-Tubulin的檢測分子量大約在55kD，因此該內參抗體不是很適合用于檢測50kD-60kD大小目標蛋白的WB實驗中。另外，不同的組織來源的樣本在選擇內參時還有一定的區別。比如一些少量特殊的情況下，如脂肪組織或細胞內，β-Actin的表達量就很少，不適合做內參。
問題9：線粒體內參抗體選擇
細胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase，簡稱COX)是一種異源寡聚酶，通常含有13個亞基，定位于線粒體內膜，是線粒體呼吸鏈的酶復合物。細胞色素c氧化酶中形成催化中心的3個最大的亞基由線粒體DNA編碼，其余10個亞基包括COX IV由細胞核內的基因組DNA編碼。細胞色素c氧化酶(COX)活性缺陷和人類多種疾病相關。COX IV抗體可用作線粒體蛋白上樣量的內參抗體，其檢測目標蛋白大小為16kD左右。
常用的細胞總蛋白質內參有GAPDH和細胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。對于一些植物的樣本，則需要特別的植物Actin蛋白作為內參。當實驗樣品中只是核蛋白，而不是細胞總蛋白提取液時，可以用組蛋白H（Histone H），或者增殖細胞核抗原（PCNA）等為核內參抗體。而在一些特別的針對線粒體作為微環境的研究課題時，需要提取線粒體總蛋白并檢測其中的目標蛋白含量，這時候常規的細胞總蛋白內參就不是很合適，我們推薦使用線粒體總蛋白的內參抗體，對于線粒體蛋白的檢測，常用COX IV或VDAC1作為內參抗體，這里面COX IV又是被引用最多的線粒體內參。COX IV的檢測分子量大約在16kD左右，比較適合用于檢測目標蛋白在較大的WB實驗。
如果您想買到一支性價比更高，質量有保障的COX IV抗體，我們向您推薦美國EarthOx公司的E021100 anti-COX IV Mouse Monoclonal antibody，效價高，建議濃度為1:1000，但在實際應用中，有科研人員能做到1:5000甚至更高。
問題10：HA標簽抗體如何選擇
HA標簽系統利用一個HA (流感病毒血凝素，influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA)短肽肽融合到目標蛋白。HA標簽可位于蛋白質的C端或N端，該系統已廣泛應用于多種細胞類型，相應的HA標簽抗體也被廣泛應用。HA 標簽抗體能特異識別C末端或N末端帶有HA標簽(HA-tagged)的融合蛋白，也可以用于檢測和HA tag融合表達蛋白的表達、細胞內定位，以及純化、定性或定量檢測HA tag融合表達蛋白等。
問題11：選擇合適HA標簽抗體需要考慮的因素
我們在選擇一個標簽抗體時，主要根據自己實驗應用上的需要。這里需要考慮的因素包括，HA抗體的應用檢測類型、HA抗體的克隆性及制備來源等。比如該HA抗體是否能用于免疫熒光IF的檢測？是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP實驗？是否需要HRP偶聯的單克隆HA標簽抗體？還是一個兔來源的HA多抗更合適？美國EarthOx的HA標簽抗體，單抗、多抗、HRP標記俱全，而且新推出幾種不同克隆號混合型的Mix產品，方便客戶的選擇，能夠滿足不同實驗室的要求。同時性價比也非常高，效價一般在1:5000左右，物美價廉的選擇。
問題12：His標簽抗體的選擇
His標簽是由6個組氨酸(His-His-His-His-His-His)組成的短肽,專門設計用于重組蛋白質的吸附純化。由于分子量較小，并且較容易分離和純化，His-tag 融合標簽與其他標簽相比有很多明顯優勢, 是目前用于純化的融合標簽中使用最為廣泛的一種。His抗體可以用于檢測和His標簽融合表達蛋白的表達、細胞內定位，以及純化、定性或定量檢測His融合表達蛋白等。
選擇His抗體時，其中需要考慮的因素包括了，His抗體的應用檢測類型、His抗體的克隆性及制備來源等。比如該His抗體是否能用于Western Bloting的檢測？是否可以用于免疫熒光IF實驗？我是否需要特異性更好的單克隆His標簽抗體？我是否需要考慮下是選擇小鼠來源的還是兔來源的His抗體？
另外，應用類型越多，在使用過程中的選擇余地就越大，而小鼠源的單克隆抗體一般在特異性、穩定性以及效價都要優于多克隆抗體。但具體情況也要根據實驗情況來選擇。
我們推薦美國EarthOx品牌的His標簽抗體，有單抗、多抗等可供選擇，效價高，質量穩定可靠，很多科研人員使用后都對該品牌抗體表示非常滿意。
問題13：GFP標簽抗體單抗和多抗的選擇
GFP（Green Fluorescent Protein，綠色螢光蛋白）是由下村脩等人在1962年在一種學名Aequorea victoria的水母中發現。其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色螢光。GFP標簽可位于蛋白質的C端或N端，該系統已廣泛 應用于各種細胞類型，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等，相應的GFP標簽抗體也被廣泛應用。一般來說，GFP抗體不僅可以檢測Abbkine GFP抗體—綠色熒光蛋白的單克隆和多克隆標簽抗體GFP或其適當的突變體，也可以檢測和GFP或其適當的突變體融合表達蛋白的表達、細胞內定位，以及純化、定性或定量檢測GFP融合表達蛋白等。
問題14：如何選擇合適和最具性價比的GFP抗體？
我們在選擇一個標簽抗體時，主要根據自己實驗應用上的需要。這里需要考慮的因素包括，GFP抗體的應用檢測類型、GFP抗體的克隆性及制備來源等。 比如該GFP抗體是否能用于免疫熒光IF的檢測？是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP實驗？是否需要特異性更好的單克隆GFP標簽抗體？一般來說，應用類型越多，在使用過程中的選擇余地就越大，而小鼠源的單克隆抗體一般在特異性、穩定性以及效價都要優于多克隆抗體。另外，抗體的效價也是考察該抗體性價比的重要方面，也即相當于實際應用時的稀釋比率。
美國EarthOx公司提供多種GFP標簽抗體供科研客戶選擇，不只有不同克隆號的單抗可供選擇，還有不同克隆號的單抗混合型的Mix產品。多抗方面既有兔多抗也有小鼠多抗可供客戶選擇。一些客戶還使用EarthOx的GFP標簽抗體發表了高影響因子的文章（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23696751）。
問題15：Myc標簽抗體的選擇
Myc標簽相當于人的c-Myc 410-419位肽段（序列為：EQKLISEEDL）。Myc標簽可放在C端或N端，但Myc重組蛋白的低pH洗脫條件往往會降低蛋白質的活力，因此 Myc標簽系統廣泛應用于檢測但很少用于純化。Myc標簽已成功應用于WB雜交技術、免疫沉淀IP和流式細胞術中。因此可用于檢測重組蛋白在細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳細胞中的表達情況。我們在選擇一個標簽抗體時，主要根據自己實驗應用上的需要。這里需要考慮的因素包括，Myc抗體的應用檢測類型、Myc抗體的克隆性及制備來源等。比如 該Myc抗體是否能用于免疫熒光IF的檢測？是否可以用于Western Bloting和免疫沉淀IP實驗？是否需要特異性更好的單克隆Myc標簽抗體？
一般來說，應用類型越多，在使用過程中的選擇余地就越大，而小鼠源的單克隆抗體一般在特異性、穩定性以及效價都要優于多克隆抗體，而多克隆抗體則具有親和性更高的優勢。另外，抗體的效價也是考察該抗體性價比的重要方面，也即相當于實際應用時的稀釋比率。在選擇抗體的時候，不但需要考慮抗體的量，還需要考慮抗體的效價，即不同應用的建議稀釋比率。美國EarthOx公司的c-Myc標簽抗體，效價高，科研客戶給予相當高的評價
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23487454）
問題16：flag標簽抗體的選擇
Flag標簽是一個與重組蛋白相融合的由 8個親水氨基酸（DYKDDDDK）組成的多肽片斷。Flag標簽只有8個氨基酸組成，因此它不會占據其他表位與結合域，避免導致融合蛋白的功能、分泌性以及轉運發生改變。由于它的親水性特點，Flag標簽傾向于定位在融合蛋白表面，因此更易與抗體結合以及被腸激酶酶解。
我們在選擇Flag抗體時，主要根據自己的需要，特別是實驗應用上的需要。另外，一個抗體檢測后的應用類型越多，在使用過程中的選擇余地就越大；而小鼠源的單克隆抗體一般在特異性、穩定性以及效價都要優于多克隆抗體。 另外，抗體的效價也是考察該抗體性價比的重要方面，也即相當于實際應用時的稀釋比率。
美國EarthOx公司提供單抗、多抗、HRP直標flag抗體供客戶選擇，應用廣，效價高，能夠滿足不同的實驗要求，客戶反饋結果很滿意，并且已經有客戶使用flag抗體發表了高水平的文章。（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22790444）