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    藍白班篩選
    來源:凱瑞力楓  發布時間: 2013-06-23 12:08

    藍白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。
      野生型大腸桿菌產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。有色物質可以使整個培養菌落產生顏色變化,而顏色變化是鑒定和篩選的最直觀有效的方法。
    編輯本段適用方面
      設計適用于藍白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變,造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽(即α肽鏈),從而不具有生物活性,即無法作用于X-gal產生藍色物質。用于藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz\'的基因,lacz\'中包括:一段β-半乳糖苷酶的啟動子;編碼α肽鏈的區段;一個多克隆位點(MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的區段中,是外源DNA的選擇性插入位點,但其本身不影響載體編碼α肽鏈的功能活性。雖然上述缺陷株基因組無法單獨編碼有活性的β-半乳糖苷酶,但當菌體中含有帶lacz\'的質粒后,質粒lacz\'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補,具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍色物質的能力,這種現象即α-互補。
      操作中,添加IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz\'中的β-半乳糖苷酶的啟動子,在含有X-gal的固體平板培養基中菌落呈現藍色。以上是攜帶空載體的菌株產生的表型。當外源DNA(即目的片段)與含lacz\'的載體連接時,會插入進MCS,使α肽鏈讀碼框破壞,這種重組質粒不再表達α肽鏈,將它導入宿主缺陷菌株則無α互補作用,不產生活性β-半乳糖苷酶,即不可分解培養基中的X-gal產生藍色,培養表型即呈現白色菌落。
      實驗中,通常藍白篩選是與抗性篩選一同使用的。含X-gal的平板培養基中同時含有一種或多種載體所攜帶抗性相對應的抗生素,這樣,一次篩選可以判斷出:未轉化的菌不具有抗性,不生長;轉化了空載體,即未重組質粒的菌,長成藍色菌落;轉化了重組質粒的菌,即目的重組菌,長成白色菌落。

     

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